目に見えないハエ：組織の色素脱失を介して神経系を研究するための新しい方法

生物の研究は複雑なプロセスであり、精度が必要です。 最新のスキャン方法はこれに成功しています。 今日では、3次元画像で身体または個々の臓器を十分に詳細に調べることができます。 約100年前、臓器の3次元ビューは、いわば身体から臓器を取り出して生きた状態で調べることによってしか得られませんでした。 ただし、常に何らかの「しかし」があります。 しかし、最も正確なスキャナーや顕微鏡でも、100％の精度を実現することはできません。 さて、もしすべてを不必要に見えなくし、研究したい身体のその部分を見えるようにすることが可能であったなら。 SFのようですね。 同意します。 しかし、今では本物です。 今日は、ショウジョウバエの例を使用して生物をスキャンするための新しい方法の研究を知るようになります。 科学者はどのようにして普通のフルーツミッジを「見えないようにする」ことができたのか、彼らのスキャン方法はどれほど正確で、人間の病気の診断にどのように役立つのでしょうか。 これらおよびその他の質問に対する回答は、研究者の報告書でのみ得られます。 引っ張らないようにしましょう。 行こう



研究の基礎



以前の記事のいずれかで述べたように、今日のようにその主人公はショウジョウバエでしたが、この小さくて実際には迷惑な昆虫は多くの研究の主題です。 科学者はその助けにより、空気力学から神経系まで、非常に多くのことを研究しています。 そして、今日議論されるのは後者についてです。 このような小さな生物におけるこのような複雑なシステムの研究には、特定の困難が伴います。 生物を多くの極薄層に切断することにより、生物を研究する方法にすでに慣れています。 この方法により、多くのシステムをより詳細に調べることができます。 しかし、神経系に関しては、この方法は、研究者によると、細胞の完全性を侵害し、システムの個々の部分を研究するプロセスを複雑にします。







物理的な「階層化」なしで小さな生物にスキャンを適用すると、すべてのシステムが同時に表示されます。 しかし、科学者は1つのシステムのみを調査したいのに対し、他のシステムはこのプロセスを妨害すべきではありません。 そのため、彼らは見事でシンプルなアイデアを思いつきました-すべてを不可視（またはむしろ透明）にし、必要なシステムをそのままにします。



現時点では、このようなアイデアを実装するのに十分なツールがありますが、それらを組み合わせるだけです。 FlyClearと呼ばれる新しいスキャン方法の主要な要素（最初の被験者であるショウジョウバエのハエを称える）は、組織の「クリーニング」と超顕微鏡検査です。







ショウジョウバエは、理由のために被験者として選ばれました。 ほとんどの組織洗浄方法の基礎は、試験生物の遺伝子改変です。 この場合、それは蛍光です。 このプロセスは非常に複雑で時間がかかります。 ボディが大きいほど、その修正に多くの時間が費やされます。 さらに、科学者が望む方法ですべての生物を改変できるわけではありません。 ショウジョウバエは非常に簡単に同様の遺伝子操作に適しているため、このプロセスにはそれほど時間がかかりません。



現在、生物を研究する最も一般的な方法は共焦点顕微鏡法ですが、組織の解剖後にのみ行われます。 問題が発生します-分析しない場合は？ この場合、低品質の淡い画像が得られ、プロセス自体に時間がかかります。 特にショウジョウバエのように組織の色素沈着が増加すると、サンプル中の光子の強い吸収と散乱も観察されます。 したがって、サンプルをきれいにする、つまり透明にする必要があります。 したがって、信号強度の低下を平準化し、均一な空間分解能を実現します。 組織を「不透明」（架空の言葉で言い訳）にする主な方法は、細胞成分間の境界で屈折率を下げることです。



研究者は、生地を透明にするための古典的な方法がすでにいくつかあることを否定していません。 ただし、これらの方法には多くの欠点があると主張しています。 形態の保存、蛍光の安定性、走査深さなど-これらすべての側面で、既存の方法は、控えめに言っても大丈夫ではありません。 さらに、いずれも組織の完全な色素脱失を引き起こしません。



小さな体のより良いスキャンのために、組織の断面を実施することが依然として必要であることが判明しましたか？ そうでもない。 科学者たちは、例として同じショウジョウバエを引用しています。 ショウジョウバエ感覚ニューロンは、その周辺領域（足、目、触角）に位置し、多数の神経や脳と非常に長いつながりを持っています。 これらの領域が階層化されている場合、これらの領域で神経系がどのように構成されているかを完全に把握することはできません。



この研究では、FlyClearメソッドによりショウジョウバエ組織の色素沈着を除去し、神経系を露出させることができました。 約1か月かかりました。 また、超顕微鏡検査により、最小の神経接続を視覚化し、ミッジの神経系の完全なマップを作成することができました。 物質も大きな役割を果たし、その助けを借りて、神経系を明るい緑色で「着色」することができました-緑色蛍光タンパク質（以下、ZFBと呼びます）。 クラゲAequorea victoriaから取得したこのタンパク質の遺伝子は、テストサンプルの遺伝子改変に特に使用されます。





クラゲエクオレアビクトリア。



蛍光顕微鏡によって得られたデータは、高解像度の3次元画像を作成できる特別なアルゴリズムによって処理されました。



研究準備



ショウジョウバエの組織の光学洗浄は簡単なプロセスではありません。 キチン質の外骨格および小面の眼の色素は、処置のためにミッジ体の最も難しい領域です。 研究者が独自のFlyClearを作成したため、現在利用可能なティッシュクリーニングの方法は理想とはほど遠いです。



FlyClearは、以前の方法のいくつかを組み合わせています。 このプロセスの最初のものはCUBIC（透明で遮るもののない脳イメージングカクテル）です。 以降の手順は、サンプルの状態（幼虫または成虫）によって異なります。





FlyClearプロシージャのバリアント。



幼虫の場合、0.03％のプロテアーゼとホルムアルデヒド固定が使用されます。 事実、プロテアーゼはタンパク質のアミノ酸間のペプチド結合を分解し、これが組織の「変色」に役立ちます。 次に、アセトンを透過処理（細胞膜の透過性の変化）のためにサンプルに使用します。



科学者は、[CH ₃ CH（OH）CH ₂ ] ₂ NCH ₂ CH ₂ N [CH ₂ CH（OH）CH ₃ ] ₂ （N、N、N '、N'-テトラキス（2-ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン）C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄ （2.2 '、2 "、2"'-（エチレンジニトリル）テトラエタノール））。 この変更により、複雑な領域（目と表皮）を含む完全な組織の色素脱失を達成することが可能になりました。



したがって、完全な組織の色素脱失の方法は機能します。 次に、研究の2番目の重要な段階である蛍光を確認する必要があります。 より正確には、ショウジョウバエが遺伝子操作後にすでに低い蛍光を持っていることを考えると、新しい試薬C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O _4が蛍光シグナル_を抑制するかどうかを確認する必要があります。 テストでは、サンプル（ショウジョウバエの体）を半分に分けました。半分は未処理で、2番目は処理ありでした。 分析では、C ₁₀ H ₂₄ N ₂ O ₄を使用するとZFBの重大度レベルが実際に低下することが示されましたが、これは全体的な精度には影響しません。 そして、同じ試薬で高度な組織の色素脱失を達成できるという事実に感謝します。 つまり、この試薬の利点はその欠点を平準化しました。



完成したサンプルは、いわば考慮する必要があり、このために、高度な超顕微鏡を使用しました。これにより、すべての平面で同じ解像度のサンプルの画像を取得できます。





光学系：1および3-平凸非球面シリンドリカルレンズ。 2-パウエルレンズ; 4-楕円形のアポダイジングソフトアパーチャ。 5および6-シリンドリカルレンズ。



通常、標準的な超顕微鏡検査では、円柱レンズと長方形の開口部を使用します。 この研究では、ビーム形状を改善して特性を改善した極薄に変更する追加コンポーネントを使用しました。



球面レンズの使用は、歪みがなく、収差が最小限の画像を取得できるためです。



標準の開口部も楕円形のアポダイジングソフト開口部に変更されました（上記の画像の番号4）。 新しい開口部は、光学システムの不要な強度分布を排除しました。



調査結果



以下は、ショウジョウバエ生物の特定のシステム（呼吸器、視覚、神経など）であり、ZFBによって強調されていますが、組織の残りの部分は完全に色素脱失しています。



記事を広げないために、私はすべてをネタバレの下に隠しました。



















ためらうことなく科学者は、研究の最大の成果を、神経系の完全な3次元マップを作成する能力と呼びます。 そして、このシステムがそのような小さな生物（ショウジョウバエ）に属すると考えると、この成果はさらに重要になります。



この新しい手法により、特定のニューロンが脳内および脳内のどこにどのように接続されているかを正確に判断できます。 断面が使用された場合、これは達成されなかったでしょう。







科学者たちは、その手法の能力を実証するために、2種類のショウジョウバエ視覚系ニューロンを示しています。DCN-背部クラスターニューロンとMCN-脳円柱ニューロン（脳の後部の皮質柱）。 脳の背外側領域では、DCNクラスターが交連化合物を形成して、視葉の髄質と小葉のシナプスニューロンを興奮させます。 （ a 、 c上の画像）。



画像bおよびdでは、ニューログリア神経細胞のホモ接合変異体の交連化合物の損失が見られます。 神経系のこれらの変化は、FlyClear細胞精製プロセスと正確に関連しています。







3次元の再構成を構築するために、2つの直交方向から写真を撮影し、それらを組み合わせました。 3D FFTベースのアルゴリズムは、2つの画像スタックのいずれかでより明確に見えるサンプルの詳細を決定します。 さらに、これらすべてが1つの3次元再構成に結合されました。



研究をより詳細に理解したい人は、科学者のレポートとそれに追加された資料を読むことができます。



エピローグ



科学者は自分の仕事を誇らしく自慢しているわけではありません。 断面による階層化の方法は、生物の研究分野で支配的でした。 しかし、この方法には多くの利点がありますが、大きな欠点があります。 特に、切開​​は細胞および組織の完全性に違反するため、特定の身体システムの再構築プロセスが複雑になります。



すべての詳細が重要な場合、複雑な神経系を持つ生物を探索するのがはるかに簡単になります。 科学者はより多くのデータを取得できるようになります。これにより、それらのデータや体内の他のプロセスをより詳細に説明できるようになります。



また、ショウジョウバエはこの研究では実験的であり、その基礎ではないことを忘れないでください。 新しいスキャン方法を改善することも、その人に役立ちます。 また、身体とその構成要素を研究するためだけでなく、現在利用可能なスキャン方法では判断できない初期段階に隠れている可能性のある疾患の診断にも使用できます。



研究は、動物の新しい種、新しい物質、プロセス、現象など、多くの新しいものを開きます。 しかし、研究ツールを作成することを目的とした研究がなければ、このすべては不可能でした。





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