HIV診断のための分子マイクロモーター速度分析

ヒト免疫不全ウイルスまたは単にHIVは20世紀のペストです。 かなり大きなタイトルですが、大げさではありません。 この病気は何百万人もの命を奪いました。 そして毎年、この潜行性疾患の犠牲者の数が増えており、HIVの治療と診断を目的とした研究の数も増えています。 あらゆる病気、およびHIVも例外ではありませんが、発達の初期段階で治療するのが最も簡単です。 しかし、これには、最初の症状が現れる前であっても、できるだけ早くそれを認識する方法が必要です。 たとえば、指を切ると、カットが表示されます。つまり、何を治療するかが明確にわかります。 HIVは、それ自体を明らかにすることなく、つまり無症状で、かなり長い間、人体に住むことができます。 今日、私たちはスマートフォンに接続された小さなデバイスを介して免疫不全ウイルスの存在を迅速かつ正確に判断できる新しい発明を検討します。 このイノベーションはどのように機能し、その結果はどの程度正確であり、研究者は将来どのような計画を立てていますか？ 私たちは、研究グループの報告書でこれらの質問や他の質問に対する答えを探します。



理論的根拠



病気について話すことは不快ですが、必要です。 彼らについてもっと知れば知るほど、自分たちと愛する人たちを彼らの影響から守ることができます。







HIV-ヒト免疫不全ウイルスは、前世紀の80年代初頭にひどい顔をしかめました。 それから誰もそれが何であるかを知りませんでした、そして、ウイルス自体は名前さえ持っていませんでした。 さらなる研究により、HIVは最も重要なシステムの1つである体の免疫系の細胞に感染するレトロウイルスであることが示されています。 ウイルスの働きの結果は、免疫防御の抑制とエイズ（後天性免疫不全症候群）の発症です。 この状態では、身体は無防備のままであり、どんな軽度の感染症（およびがん細胞）でも体に劇的な影響を与える可能性があります。 本質的に、HIVは私たちの防御を破壊し、感染に直面した敵が冷静に体を引き継ぎます。



HIVには感染の接触メカニズムがあります。 感染は、血液、精液、母乳、前播種液、または膣分泌物との接触によって発生する可能性があります。 言い換えれば、無防備な性交、感染した医療器具、そしてタトゥーパーラーの感染していない針でさえ、ウイルスを広める素晴らしい方法です。 HIVの出現の時代に、パニックがHIVが何であり、どのように拡散するかについての信頼できる情報よりも速く集団に広がったとき、感染は単純な握手によるものであると考えられていました。 これは神話です。なぜなら、ウイルスは感染した人との簡単な接触では広がらないからです。 しかし、感染のこのオプションも可能ですが、感染者と感染の可能性のある犠牲者の手に開いた傷がある場合のみです。 HIVを媒介する蚊（蚊が患者の血液を飲み、健康な人に噛まれたために彼に感染する可能性がある）が神話でもあるという事実については話していない。





世界保健機関（2017）による世界的なHIV感染率。



ウイルス自体とその診断の新しい方法についてはあまり議論しないので、ウイルスと体内でのウイルスの発達の結果については詳しく説明しません。 しかし、HIVは感染した人の体内で時間とともに変化する患者ウイルスであるため、さまざまな封じ込めや治療方法に対してさらに抵抗力があることに注意してください。 これは、できるだけ早く検出する必要があるもう1つの理由です。 ウイルスの時間が長いほど、ウイルスは強くなり、感染者は弱くなります。



デバイスは何で構成されていますか？



この研究に関係する科学者は、世界の他の病気と同様に、HIVの早期診断における最も深刻な問題と障壁の1つは、実験室、人員、医療施設などの適切な条件の欠如であると言います。 そのため、彼らは体内にウイルスがあるかどうかを正確に示すことができるデバイスを作成することにしました。 血糖値は、ポータブルコンパクトデバイス（グルコメータ）を使用して、つまり、研究室を訪れて数日間テスト結果を待つ必要なく、長時間にわたってすでにチェックできます。 このようなデバイスのコストは非常に低く、その配布にも伴います。



今日知られるデバイスは、以下のように簡単に説明できます：ループ等温増幅（LAMP）およびナノモーター（CALM）に基づくHIV-1の分子決定のためのモバイルアナライザー。 そして今、順番に。



ナノモーター



ナノモーター（マイクロモーターとも呼ばれます）は、運動中のエネルギーを変換できる微視的分子デバイスと呼ばれます。 それらが特定の化学溶液に入れられた場合、それらは特定のルートに沿って独立して動き始めます。これは、診断、さらにはナノテクノロジー機器のエネルギー供給に使用できます。





HIVテスターのマイクロモーター形成スキーム。



マイクロモーターは、密度が1.04 g / cmのPt（プラチナ）ナノ粒子でコーティングされたポリスチレン製の球体です。 さらに、Au（金）ナノ粒子は、マイクロプローブをDNAプローブで修飾するためにも使用されました（上の図では、赤い「触手」として表示されています）。



TEM（透過型電子顕微鏡）は、マイクロモーターのコーティングに使用される白金と金のナノ粒子が球形であり、直径が57.721±5.181 nm（Pt）および3.4​​3±1.336 nm（Au）であることを示しました。





上記は、TEM画像、ナノ粒子を調製した写真フラスコ、および光学分光法の結果です。



完全に形成されたマイクロモーターのDNAプローブがどの程度効率的にDNA分子を捕捉できるかを確認する必要がありました。 このために、 アガロース* （C ₁₂ H ₁₈ O ₉ ）ゲル電気泳動法を使用しました。

アガロース*は、1→4結合で結合した一連のβ-D-ガラクトピラノース残基と3,6-無水物-α-L-ガラクトピラノースによって形成される線状多糖です。 寒天から入手。

この手法により、マイクロモーターの表面にDNAプローブがあることが確認できました。これは、約180 bpの人工DNA分子（対になった塩基）を結合できたためです（このような（人工の）サンプルでは優れた結果です（左の画像））。 最初のテスト中の捕捉効率の程度は約30％であり、これは蛍光分析によって確認されました（左の画像）。





ここでは、さまざまな濃度のH ₂ O ₂ （0、5、10、および15％）の溶液中でマイクロモーターがどのように動くかを確認します。



また、マイクロモーターの最も重要な機能である動きを確認する必要がありました。 このために、H ₂ O ₂を含む溶液と含まない溶液を_{使用しました} （下の画像dの軌跡の比較）。 過酸化水素が存在しないと、マイクロモーターが振動しましたが、これはブラウン運動によるものです。 H ₂ O ₂が溶液に導入され始めたとき、マイクロモーターの速度は、溶液中の1％過酸化水素ごとに約0.7μm/ s増加しました。





試験溶液中のマイクロモーターの速度の測定。



図aは、直径6μmのマイクロモーターの速度と溶液中のH ₂ O _2の濃度の依存性を示しています。 また、（右側）は、マイクロモーターとその軌跡のスナップショットです。 図bは、5％過酸化水素溶液におけるさまざまな温度でのマイクロモーターの安定度を示しています。 以下（グラフとスナップショット）に、安定性インジケーターが時間（120秒）とともにどのように変化するか、および15％のソリューションで既に移動している軌跡を示します。 時間に対する二乗平均平方根変位をグラフeに示します。黒い点-H ₂ O _2のない溶液、赤-5％H ₂ O ₂



以下の画像fでは、マイクロモーターが配置されているソリューションの状態がその動作に影響するだけでなく、マイクロモーター自体、より正確にはその構造も大きく変化していることがわかります。 直径6μmの本格的なテスト済みマイクロモーター（赤線）と比較して、プラチナと金からのスプレーなしで直径3μmのマイクロモーターがどのように動くか（青線）を確認します。 軌跡の比較の右側には、マイクロモーターの平均二乗変位の比較があります（直径3μmと6μm）。



モバイル機器



Motorola XT1575（Android OS）は、マイクロモーターの視覚化と追跡（つまり、診断の発生状況の監視）に使用されました。





デバイスの外観と詳細。



デバイスの重要なコンポーネントは、マイクロモーターの動きを確認するために必要なチップです。 ポリメチルメタクリレート（プレキシグラス）でできていました。 80 mmの接着剤層を使用して、幅2 mmのレーザーカット「チャネル」を備えたガラスベースを取り付けました。





チップの外観と寸法。



上の写真からわかるように、デバイスの一部はチップだけではありません。 青い取り外し可能なケースは、3Dプリンターで安価な素材で作られていました。 このケースの中には、白色LED、3.3 Vバッテリー、スイッチ、安価な光学レンズがあります。 また、レンズと携帯電話のカメラの間にサンプルを置くことができるサンプルホルダーがあります。



そして今、ソフトウェアコンポーネントについて。 ソフトウェアは、OpenCV 3.1.0ライブラリを使用してAndroid Studioで作成されました。 科学者によると、インターフェースはユーザーにとって可能な限り明確で実用的です。





HIVテスターインターフェイス。



サンプルがデバイスに配置されると、プログラムはビデオ（30 fps、320x240ピクセル）を記録します。このビデオは、マイクロモーターの動きを示し、その動きの速度を計算し、1分以内に分析結果を示します。



ループ等温増幅（LAMP）



HIV-1の認識におけるマイクロモーターシステムの効果はどれくらいですか？ この質問に対する答えは、LAMP反応にあります。 テストのために、異なる濃度のHIV-1 RNA（リボ核酸）でいくつかのサンプルを調製しました。 増幅結果をアガロースゲル電気泳動で評価しました。





LAMPテスト。



電気泳動の結果は、大きなDNAアンプリコンの段階的な形成を示した（DNA配列、増幅結果）。 アンプリコンの数は、HIV-1 RNAの濃度に比例しました。



マイクロモーターはHIV-1 RNAアンプリコンと混合され、ハイブリダイゼーションプロセス（温度80℃）を受けることが可能になりました。 次に、得られた「混合物」をH ₂ O _2の 5％溶液でテストしました。 HIV-1 RNAのアンプリコンがシステムに存在すると、マイクロモーターの速度は約95.26％低下しました。 低濃度のアンプリコン（約3.394±0.245 ng /μl）でも速度の低下が観察されます。





HIV-1 RNAの非存在下での微小運動の実証。





HIV-1 RNAの存在下での微小運動の実証。



科学者はまた、マイクロモーターとその速度を回復することに成功しました。 このために、マイクロモーターとアンプリコンを含む「感染した」サンプルを90℃の温度で30秒間インキュベートしました。 これにより、マイクロモーターDNAプローブからアンプリコンを解放することが可能になりました。 その後、6000 x gで5分間遠心分離しました。 H ₂ O _2の 5％溶液で得られたサンプルの検証により、HIV-1 RNAアンプリコンを使用してテストする前に、マイクロモーターの速度が初期速度の75.52％のレベルに回復したことが示されました。



C型およびB型肝炎、ヘルペス、パピローマウイルス16（HPV-16）など、他のタイプの性感染ウイルスに対するシステムの反応もテストされました。 HIVと上記のウイルスのいくつかに並行感染が頻繁に起こるため、このテストも非常に重要でした。 結果は満足のいくものでした-DNAアンプリコンはHIVの存在下でのみ形成されました。 つまり、テストサンプルに他のウイルスが存在しても、チェックプロセスに影響はありませんでした。



結論は簡単です-メソッドはHIVの存在を判断できます。 しかし、システムがサンプル中のウイルスの有無を区別できるように、標準濃度の1000粒子/ mlに焦点を合わせて、キャリブレーションを実行する必要があります。 濃度がこの指標より低い場合、結果は陰性（ウイルスが存在しない）であり、濃度が高い場合、結果は陽性です。 キャリブレーションを実行するには、マイクロモーターの速度が濃度に対応するかどうかを判断する必要がありました。 このために、PBS-研究用の特別な溶液であるリン酸ナトリウム緩衝液とHIVの有無にかかわらず患者の血漿を使用しました。



合成安定化HIV-1 RNAの濃度が0〜107の範囲であるPBSを使用して、キャリブレーションを実行しました。



キャリブレーション後、HIV濃度1000での平均マイクロモーター速度は0.705±0.082μm/ sであることが明らかになりました。





HIV-1 RNAの濃度を決定した結果。



科学者はROC曲線を使用してシステムを分析し、非常に有望な結果を示しました。 テストされたシステムの感度*は、 CI * 81.8〜99.3％で約94.6％、 特異度* 80.5〜100％のCIで99.1％でした。

感度* -肯定的な結果の割合を反映する指標（この場合、サンプル中のHIV濃度が1000を超える確率です）。



特異性*は、陰性結果の割合を反映する指標です（この場合、サンプル中のHIV濃度が1000未満である確率です）。



DI * -信頼区間、つまり、特定の信頼性を持つ未知のパラメーターをカバーする区間。

システム結果の散布図も信じられないほどの結果を示しました。 したがって、HIV濃度が高いサンプルを陽性と判定する精度は100％であり、陰性サンプルを判定する精度は90％です。







この研究をより詳細に理解したい人は、科学者の報告とそれに追加された資料を調べることができます。



エピローグ



この驚くべきデバイスを作成した科学者は、まだ多くのテスト、キャリブレーション、改善を実施していないことを否定していません。 しかし、それらは明らかに正しい軌道に乗っています。 このようなデバイスは、特にスタッフと多数の医療機器を備えた研究所が利用できない場所にいる人々の間で、HIVのspread延を大幅に減らすことができます。



はい、デバイスはまだ非常にコンパクトに見えず、スマートフォンを使用する必要があるという事実は、誰かを追い払う可能性があります。 しかし、将来的には、HIVの早期診断のためのこのような技術は、効率と精度だけでなく、利便性と手頃な価格の面でも改善され続けるでしょう。



この話の冒頭で書いたように、HIVは20世紀の疫病です。 しかし、残念ながら、このウイルスは「XXI世紀のペスト」というタイトルからそれほど遠くはありません。 今日、いくつかの病気はすでにそのような大きなタイトルを主張しています（例えば、うつ病、糖尿病など）。 そして、これらの病気のそれぞれは大きな注意を必要とします。 また、病気を治す魔法の薬はありませんが、利用可能な診断方法を改善することしかできません。これにより、治療を検索したり、病気を封じ込めたりする時間が増えます。 彼らが言うように、問題を早く知るほど、それを解決する機会が増えます。



もう1つの重要なポイントは、社会活動、オープン性、議論です。 問題について話し合うべきです。それについて話すのが怖い場合でも、社会はどのようにそれと戦うつもりですか？



いずれにせよ、それは私にとってすべてです。 自分と愛する人の世話をします。



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