自分撮り用ではない：スマートフォンに埋め込まれた新しいチップを使用したデジタル酵素結合免疫吸着アッセイ

どの病院のどのオフィスから子供や大人が時々叫びますか？ 蚊に刺されたと比較して、子供の頃に私たちを厚かましく欺く親は何ですか？ これは血液検査だと既に推測したと思います。 現在、この手順はより速く、痛みが軽減されています。 一つのことは変わっていません-その重要性。 医学の診断は、病気との戦いの初期段階で最も重要な役割を果たします。 結局のところ、病気を打ち負かすためには、まずそれを発見しなければなりません。 分析のために血液サンプリング手順を生き延びた後、あなたは静かにその結果を待つために出発しました。 現時点では、研究所では、複雑でかさばる非常に高価なデバイスを使用している人々が血液を分析し、血液の内容と量を調べます。 地元の病院にそのような研究室がある場合は良いことですが、常にそうとは限りません。 しかし、小型で安価なポケットラボがあり、同時に通常のサンプルと同じ精度と効率でサンプルを分析した場合はどうでしょうか？ SFのようですね。 当時の「ポケット血糖アナライザー」というフレーズも未来的でした。 今日、私たちは新しいタイプのコンパクトなデバイスを通してタンパク質とアミノ酸の定量分析のための技術の研究と実装を知るようになります。 この奇跡は何から成り立ち、どのように機能し、どの程度効果的ですか？ 科学者のレポートでは、これらの質問やその他の質問に対する回答を受け取ります。 行こう

研究の基礎

私たちはデジタル技術の時代に生きており、私たちの生活のさまざまな分野で成功裏に実施されています。 臨床検査（診断）も例外ではありません。 科学者は、デジタルドリップ分析は従来の1000倍の精度であり、フェムトリットル（fl、1 fl = 10 ^-15 L）で測定されたサンプルの1滴で数百万の分析を並行して実行できることに注目しています。



デジタル分析の使用は、核酸やタンパク質の検出、個々の細胞、さらにはエキソソームの分析に非常に役立ちます。

エキソソーム* -細胞外小胞（直径：30〜100 nm）。細胞によって細胞間スペースに分泌されます。 エキソソームは、免疫、タンパク質分泌などの作業に関与しています。

現時点では、最も有名なデジタル分析方法は、dELISA（デジタル酵素免疫測定法/ ELISA）およびqPCR（デジタルポリメラーゼ連鎖反応）です。 これらの手法により、個々のセルを操作しながら、修正を必要としない非常に正確な結果を得ることができます。 そこで最近、これらの方法を使用して、1つの細胞のタンパク質とmRNAを同時に定量的に分析することに成功しました。



同様の手法と彼らの才能のデモンストレーションは、非常に小さな環境（サンプル）内での並列分析の実装が非常に可能であることを再度示しています。 ただし、他の技術と同様に、これらの方法にも欠点があります。 寸法、価格、製造の複雑さなど、非常に簡単です。 研究者は、デジタルアンプ（QuanterixのSimoa）の1つのインストールには約100,000ドルかかることを思い出させます。 そして、すべての私立クリニックがそのような金額を支払う余裕があるわけではありません。



もちろん、この「獣」のQuanterixのSimoaは、誇張されていれば非常に強力です。 それぞれ40 flの200,000セルのマイクロセルタブレットを使用します。





Quanterixのシモア



同時に、このデバイスは、それぞれ96細胞のELISAタブレットを4つまで並行して処理できます。 したがって、1つのデバイスで1時間以内に66個のサンプルの結果を生成することができ、各サンプルを10プレックス分析にかけることができます（つまり、一度に10個の指標について1つのサンプルを分析します）。 数字は本当に信じられないほどです。 しかし、再び、そのような奇跡の機械の価格と寸法の問題が生じます。





イメージNo. 1



そして、ここで科学者は、マイクロ流体液滴システムに目を向けることを提案します。 この種の従来のシステムは、QuanterixのSimoaの巨大なパフォーマンスを誇ることはできませんが、新しいデバイスの基盤として使用できます。 連続流マイクロ流体液滴技術は、理論的に最大100万個の細胞を分析できます。 ただし、実際には、このような指標はいくつかの理由でまだ達成されていません。 まず、スループット（1秒あたり104ドロップ未満）、ドロップが連続して（並列ではなく）生成され、単分散である場合。 第二に、各液滴の蛍光の検出は、それらを一度に1つずつレーザースポットに通過させることによって実行されます。 つまり、すべてが1つずつ並んでいます。 このプロセスを画像1aに示します（分離、インキュベーション、測定; 10 ⁷滴の分析に3時間）。



この方法をコンパクトな形式に変換する主な問題は、蛍光の多色検出のための光学系の並列化の難しさ、サンプル調製プロセスの統合の複雑さ、厳密に制御された液滴流を生成する特定のツールの必要性です。 しかし、科学者は、どんなに印象的であっても、困難に直面してあきらめることに慣れていません。



マイクロドロップメガスケール検出器（MD、マクロ検出器）は、今日のヒーローの創造物です。 このデバイスは、モバイル（ハンドヘルド）デバイスに実装できるだけでなく、通常のフルサイズの研究所の定量分析の基準も満たしています。 このプロセスを画像1bに示します（分離、インキュベーション、測定; 10 ⁷滴の分析には10分）。



これを達成するために、研究者によると、3つの主要なタスクが実装されました：

1. 1滴ずつ生成する代わりに、マイクロ流体液滴の並列生成が使用され、100倍高速に動作しました。 また、単分散液滴の製造分野の仲間の科学者の成果（ この研究へのリンク ）により、液滴の単分散性の流量依存性を取り除くことができました。 これにより、モバイル（ハンドヘルド）デバイスに統合できる非常に安価なper動ポンプを使用できます。
2. 1秒あたり105を超える速度での液滴の蛍光の高速読み取り（上記の104の制限を思い出してください）は、従来の読み取り（液滴が順番に読み取られる場合）よりも100倍速い携帯電話に基づく視覚化のおかげで達成されました。 この場合、高価な光学機器は不要であり、ハンドヘルドモバイルデバイスでの実装は明らかです。 この革新の主な特徴は、デジタル画像の低フレームレートの制限を克服し、異なる色のLEDまたはレーザーダイオードのいくつかの励起源を固有の非周期信号で変調することにより、多色蛍光検出を提供する機能です。 ビデオをデコードして、液滴の蛍光データを取得し、カメラのフレームレート制限を克服できます。 したがって、1秒あたり100万ドロップというまさしく（前述）を達成することができます。
3. そして最後に、マイクロビーズ（またはマイクロビーズ、微小球体）の処理ユニット、液滴発生器、液滴のインキュベーションのための信号遅延線、および蛍光検出器の統合。 これにより、未処理の血清（サンプル）を入力し、分子データ（結果）を出力するための安価でコンパクトで効率的なデバイスが提供されます。

彼らの発明の実証として、科学者は蛍光色素から得られた異なる色の微小顆粒を使用して多重化されたDIGAを実装しました。 各色は、マイクロビーズ抗体が対象とするタンパク質の「コード」です（ 1c ）。



血清GM-CSFとIL6サイトカインのマルチプレックス分析は、紫外線と緑色の蛍光顆粒を使用して行われました。滴が蛍光赤色免疫複合体を含む微小顆粒を含んでいた場合です。 ウシ血清を定量分析の培地として使用し、測定限界は0.004 pg / ml（ミリリットルあたりのピコグラム、1 pg = 10 ^-12 g）でした。 これは、標準ELISAの1000倍の精度であり、デジタルELISAの精度レベルに対応しています。



1000万のドロップを処理するのにわずか10分かかります。 この場合、プロセス自体には、液滴の生成とインキュベーション、および各サンプルの蛍光液滴の検出が含まれます。

デバイス構造と分析プロセス

画像＃2：MDデバイス構造。



上の画像についてもう少し詳しく： 2a-チップの図、上下からの眺め。 2bは、すべての光学流体チャネルが見えるMDチップの写真です。 ２ｃは、マイクロビーズを直径４０ミクロンの液滴にカプセル化するプロセスの顕微鏡写真である。 2dは遅延線後の液滴の蛍光顕微鏡写真です。 2eは、MDプラットフォーム（携帯電話、3つの光源、MDチップ自体）の概略図です。



MDの主要な構成要素は微小顆粒プロセッサーと呼ばれ、後者は血清から標的タンパク質を捕捉します。 この後、顆粒は、その後の液滴内部での増幅のために免疫複合体で標識されます。 このような各プロセスの間に、繰り返し（数回）クリーニングが行われます。 微小粒子が酵素基質と混合され、水-油滴にカプセル化されている液滴発生器も存在します。



次に、液滴が3.2分間通過するマイクロ流体チャネルがあります。 このチャネルは、プロセスの遅延/減速として必要であり、蛍光シグナルを酵素的に増幅できます。 最後の部分は、液滴の蛍光が検出される携帯電話（カメラ）に基づく検出器（またはスキャナー）です。



微小顆粒プロセッサーは、顆粒を固定するための半透膜で構成されています。 いくつかの試薬と洗浄バッファーが固定化された顆粒に送られます。 この後、さらなる分析のために顆粒が放出されます。



膜自体はポリカーボネートでできています。 直径3μmの細孔を有する300mm ²のエッチングされたトラックが膜上にエッチングされた。



この実験では、2つのグループの微小顆粒がありました：（d = 5.4μm、ex / em = 470/490 nm、CFH-5052-2）、抗GM-CSF抗体で機能化（MAB2172）および（d = 4.5 μm、ex / em = 370/410 nm、CFP-4041-2）抗IL6抗体で機能化（MAB206）



まず第一に、微小顆粒はサンプルと一緒に1時間インキュベーションプロセスを通過し、その後、上記の膜に捕捉されます。



この段階（膜内）で、顆粒を1mlのT20緩衝液で10ml /時間の流速で洗浄し、0.1mlの0.7nM検出抗体とT20緩衝液で0.5時間インキュベートし、1mlのT20緩衝液で再度洗浄する。 10 ml / hで、その後、流量を6 ml / hに変更することにより、膜から放出されます。



この後、放出されたマイクロビーズをELISA基質と混合し、直径40μmの液滴にカプセル化します。 顆粒と基質の正確な混合を確保し、蛍光シグナルを生成する酵素からのバックグラウンドシグナルを最小限に抑えるために、長さ14 mmの特別なチャンネルが使用されます。



液滴発生器は、液滴の直径が流量に依存しないように設計されています。 このデバイスでは、このようなジェネレーターは100個しかなく、出力では毎秒100,000ドロップのスループットが得られます。



各ドロップは、1つの顆粒でカプセル化されているか、そのままです。 同時に、特定の濃度が達成されます-微小顆粒よりも10滴多くなります（たとえば、20滴-顆粒のある10滴とない10滴）。 これにより、1滴で2つの顆粒が最大0.5％になる可能性が低くなります。



ドロップレットジェネレーターに続いて、チャンネル幅1.8 mm、高さ1.5 mmのスパイラルに似た遅延線があります。 遅延線は十分に長くなければなりませんが、デバイスのサイズを増やすことはできません。 したがって、4つのスパイラルが1対1で作成され、67 ml / hの流量でドロップに3.2分かかる完全に通過しました。



このようなデバイスをモバイルプラットフォームに導入するには、携帯電話のカメラに関連する特定のタスクを解決する必要がありました。 通常の一定時間の光励起を使用すると、カメラの視野内を移動する液滴がストライプとして視覚化されるという事実につながります。 このストリップの長さにより、液滴間の最小距離が設定されるため、スループットが大幅に制限されます。



擬似ランダムシーケンス（時間内）で光励起を使用すると、個々のドロップを「見る」ことができます。 光変調の速度は、カメラの露光時間の10倍です。 この違いにより、液滴はストリップを形成し、その距離（3つの液滴直径）は個々の測定に十分です。 この場合、カメラの前で120の並列ドリップチャネルをスキップできます。



検出とスキャンのもう1つの重要なポイントは蛍光です。 多重ELISAを実行するには、いくつかの異なる蛍光シグナルが必要であり、このために、3つの光源が同時に使用され、それぞれが特定の蛍光色素の励起に必要な波長を持っています。 このトリプルシステムは、2つのダイオードレーザー（青、緑）と1つのLED（UV）で構成されています。





画像3：「サンプル結果」プロセス（電話のカメラからのデータをデコード）。



電話カメラからのビデオを正確にデコードするには、3つの光源のそれぞれに対応する3つの予想される変調パターン（ m ）の相関検出を実行する必要がありました。



結果は相関ベクトル（ 3a ）でした。ここで、 k-フレーム。 n = 1：デバイスの120チャネル。 R 、 G 、 B-デジタルカメラのカラーチャンネル。 r 、 g 、 b-色の励起。



液滴パターンは、| m |で最大長シーケンス（MLS）を介して作成されました。 = 63ビット。 さらに、デジタル画像の各ビットは10ピクセルです。つまり、合計63ビットは630ピクセル（1920年のフレーム幅の1/3）です。



蛍光スキャンは、液滴に微小顆粒が含まれているかどうかを判断し、含まれている場合は色（UVまたは緑-タンパク質、赤-標的分子）を判断するために必要です。 このデータを受け取った後、それを抽出する必要があります。 これを行うには、ビデオフレームをカメラのセンサーに応じて赤、緑、青のコンポーネントに分割します（ 3d ）。



このデバイスはクラウドテクノロジーを使用していました。 これは、アイロン（つまり、電話自体）の負荷を軽減するために行われました。 ドロップまたはフェーズの速度を制御する代わりに、クラウドコンピューティングを実行して、フェーズまたは速度が不明なドロップを決定しました（ 3秒 ）。 最適な位相と液滴速度を決定した後、相関空間Ψr ^、g、b _k、n （x、υc、θc）（ 3fおよび3g ）のピークを正確に決定できます。



収集されたデータは特別なアプリケーション（これまでのところAndroid OSのみ）にアップロードされ、リモートサーバーでMATLABを使用して処理するためにクラウドに送信されます。 その後、処理済みのデータがスマートフォンに返され、画面に表示されます。



準備とテストのすべての作業の後、科学者は、作成と既存の商用フルサイズデバイスSimoaを参加させて「スパーリング」を行うことにしました。



テストの決闘では、作業媒体の3つのバージョンを使用しました：PBS-リン酸ナトリウム緩衝液、FBS-ウシ胎児血清およびヒト血清。 最も重要な指標は検出限界（LOD）、つまりサンプル中の分析物の最小含有量でした。





MDチップのテスト結果。



M-CSF（上記の画像A ）とIL6（画像B ）のいくつかの単一プレックス測定は、104から102 pg / mlまでの連続希釈を測定することにより、PBS培地で実行されました。 このテストでは、非常に良好な検出限界が得られました。GM-CSFではLOD = 0.0045 pg / ml、IL6ではLOD = 0.0070 pg / mlです。



FBSソリューションでも同様の測定が行われました（1：4）。 この段階で、分析サンプルは調査対象のデバイスと市販の「ヘビーウェイト」Simoaの間で半分に分割されました。 その結果、科学者の創造は優れた結果を示しましたが、実際にはシモアの結果よりも劣っていません（上記の画像C 、R2 = 0.95）。



しかし、それは1プレックス分析、つまり1つの指標の分析でした。 ここで、MDチップがいくつかのタンパク質の並行分析、つまりGM-CSFとIL6の二重分析を同時に処理する方法を確認する必要がありました。 まず最初に、一定量のGM-CSFをFBSに添加し、IL6の濃度はゼロでした（画像FおよびG ）。 それから反対のことが行われた：GM-CSFおよびいくらかのIL6のゼロ濃度。



どちらの場合も、検出限界は、以前に実行された1プレックス分析の結果と大差ありませんでした（GM-CSFの場合はp> 0.88、IL6の場合はp> 0.90）。



その後、一定量のGM-CSFとIL6（画像h）の両方をサンプルに加えました。 検出精度は優れていました-GM-CSFではR2> 0：99、IL6ではR2> 0:99。



最も重要なテストは、ヒト血清の分析でした。 血液サンプルは14人の被験者から採取されました。 研究者は、MDおよびSimoaチップを使用して、これらのサンプルのGM-CSFおよびIL6を定量化しました。





MDおよびSimoaを使用したヒト血清GM-CSFおよびIL6の定量結果。



MDチップを使用した分析結果は、現在最も正確な分析装置であるSimoa（R2 = 0：96）の結果に非常に近いことが判明しました。





デバイスのデモンストレーション。



ニュアンスと研究の詳細をさらに詳しく知りたい場合は、研究グループのレポートと追加資料を確認することをお勧めします。

エピローグ

医学ではスピードが大きな役割を果たします。 正確な診断が迅速に行われるほど、治療を迅速に開始できます。 時には数日でさえなくても、無駄にできない分です。 ただし、単に診断用のツールがない場合、時間は常に主な要因ではありません。 寸法、生産の複雑さ、いくつかの正確な分析装置の価格、および必要なすべてを備えた実験室の機器は、どこからでも、どこからでも遠いです。



MDチップのようなデバイスを作成することは、単に良いアイデアではなく、見事で信じられないほど重要なアイデアです。 安価な分析器は、優れた精度と速度を同時に発揮し、世界中の医療、特に標準ツールの使用が不可能な地域に大きな影響を与える可能性があります。 科学者自身によると、このようなデバイスのプロトタイプのコストは約500ドルです。 大量生産では、消費者の価格はわずか5です。



誰もが治療を受ける権利を持っていますが、多くの理由で、この権利は常にどころではなく、現実に匹敵するものではありません。 同様の研究と同様のデバイスは、それを変えるのに役立ちます。



ご静聴ありがとうございました。好奇心を保ち、良い週をお過ごしください。



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