前のシリーズの要約：
科学者は青い光の遺伝子を発見しました。 私たちはこの遺伝子について読み、明るいトランスジェニッククリスマスツリーを作るために立ち上げました。 私たちはその名前と配列を専門のリソースで見つけ、シェフからの出張をノックアウトし、動物が住んでいる場所、つまりこの遺伝子を含むボトルに転がり落ちました。
特別な機器を使用したさまざまなトリックにより、bl1遺伝子の純粋なDNA分子を取得しました。bl1遺伝子は青色のグロータンパク質をエンコードします。
遺伝子があります。 私たちは何を待っていますか、読者は尋ねます、この遺伝子を木に入れてみましょう、それは輝き始めますか？
それほど単純ではありません。その理由は次のとおりです。
遺伝子は、情報が読み取られたときにのみ機能します。 私たちの場合、これはbl1タンパク質mRNAです。 さらに、mRNA自体も機能するはずですが、これは別の話です。
第二に、遺伝子は細胞分裂中にその子孫に伝達されなければなりません。 そうしないと、すべてが排水溝に入ります。
第三-遺伝子はピンではないので、突き刺す必要があります！
遺伝子を単純に細胞に入れると、そこから情報が読み取られることも伝達されることもありません（はい、実際、それを突き刺すことには大きな問題があります）。 したがって、私たちは彼に仕事をさせ、子孫が伝わることを可能にするフォームを置くことを可能にするいくつかの公式情報を彼に掛けなければなりません。 また、どういうわけか彼をケージに入れます。
ただし、以前の段階でも、既存の遺伝子を保存しようとするため、いつでもボトルを買わずに大量に購入することができます。
最初の変換。
各段階に立っている最初のタスクは、前の段階の結果を保存することです。 プログラミングの関連タスクではありませんか？ :)
バクテリアに遺伝子を入れて、いつでもそれを増殖させてそこから必要な量を得ることができます。 これが私たちの最初のトランスジェニック生物となり、その作成のプロセスは形質転換と呼ばれます。
以前に行ったように、なぜPCRを使用して遺伝子を単純に増殖できないのですか？ 実際、PCR反応のエラーの確率は1/10 ^ 3であり、バクテリアでは1/10 ^ 6です。つまり、1000倍正確にコピーされ、絶対精度などが必要です。
それでは、バクテリアに遺伝子を入れます。これはどのようにできますか？ これを行うために、まず最初に、コンテナと呼ばれる特別な環状DNA分子を準備します。 このプラスミドは、ゲノムに関係なく細菌細胞内で浮遊し、増殖し、子孫に伝達されます。これは、このために必要な遺伝子とシグナル配列を持っているためです。
プラスミドにはマーカー遺伝子もあります。 これらは、プラスミドを持たない細胞からプラスミドを持つ細胞を選択するのに役立つ遺伝子です。 たとえば、マーカーは、染色遺伝子（プラスミドを含む細菌が染色される）または耐性（プラスミドを含む細菌が抗生物質を含む培地で死ぬことはない）です。
プラスミドはバイオテクノロジー会社で購入でき、誰にでも販売されています。 小さな試験管に透明な溶液の形で入ってくるでしょう（実際、他のDNAの溶液も同様です）。 遺伝子をプラスミドに挿入するには、制限酵素で切開する必要があります（後で説明します）が、多くの場合、すでに切開で販売されています。
FermentasからpJET1,2などの最新のプラスミドを購入したとしましょう。
そこに彼女は、美しさです。 右上隅には多くの小さな名前があります-これらは制限サイトです。 Repは、細胞内のプラスミドの複製（複製）に関与する領域であり、Ampはレポーター抗生物質耐性遺伝子であるアンピシリンです。
いわゆる「クジラ」と呼ばれる試薬一式がプラスミドに供給されます。 指示に従って、私たちの遺伝子の溶液、クジラとリガーゼ酵素からの試薬を含むプラスミドを少し滴下し、プラスミド分子が遺伝子分子と結合し、bl1遺伝子を含む単一のリング分子を得る解決策を取得します。
そのようなプラスミドは「挿入プラスミド」と呼ばれます。
リガーゼ酵素架橋DNA切片。 すべてを一列につなぎ合わせ、すべてが正しくドッキングされているかどうかを判断することはできません（たとえば、プラスミド自体を遺伝子なしでつなぎ合わせることができます）。そのため、私たちのタスクは分子を特定の方法でのみドッキングさせることです。 スティッキーエンドに関しては、もう少し詳しく説明します。
プラスミドpJet1,2は、eco471R遺伝子の中央ですでに切断されて販売されています。 この遺伝子は細胞毒をコードします-強力な制限酵素で、bl1遺伝子が挿入されていない状態でリガーゼがプラスミドを架橋し、そのようなプラスミドが細菌に侵入すると、細胞を殺します。 これは非常に便利です。他のタイプのプラスミド（このタイプは自殺プラスミドまたは「自殺プラスミド」と呼ばれます）で発生する挿入がまったくない状態でバクテリアが成長することを心配する必要がないからです。
当初、この情報は記事の範囲を超えていましたが、そうでなければ疑問があり、なぜこの遺伝子なのかと思いました:)
次に、特別に準備された大腸菌（Echerichia coliまたはE. coli）の培養物を採取し、形質転換プロトコルを使用して、挿入物を含むプラスミド溶液をそれらにドロップします。 プロトコルは異なる場合があります 。ここに例を示します。 バクテリアは非常に簡単に形質転換できます。実際、DNAはバクテリアに浸透するだけで、他のトリックはありません。
通常、形質転換は夕方に行われ、朝には細菌が増殖し、すでに結果が出ています。
増殖培地を含むペトリ皿には、多くのコロニーがあります。 各コロニーは、単一の形質転換細胞の子孫です。 それらのいくつかを選択し、PCRによってbl1の含有量をテストし（遺伝子が存在することを確認するため）、保管することができます。
細菌は非常に急速に増殖し、遺伝子を含むプラスミドをいつでも適切な量でそれらから分離することができます
だから、私たちは:)を押収し、同時にトランスジェニック細菌の培養を得ました。 それらが発光するかどうかは、選択した形質転換用プラスミド、mRNA合成のシグナル配列（プロモーター）を含むかどうかに依存します。
中間結果のこの種の保存は、オブジェクトがさらに処理されているかどうかに関係なく、常にバクテリアで実行されることに注意してください。 一緒に作業して保管すると非常に便利です（液体窒素ですばやく凍結）。
転写された配列の準備。
遺伝子配列が細胞内で機能するためには、mRNAが細胞から読み取られる必要があります（タンパク質はタンパク質から）、つまり、転写される必要があります。 これが起こるためには、制御配列であるプロモーターが遺伝子の前になければなりません。
すべての遺伝子にはプロモーターがあり、遺伝子が合成される条件の原因となりますが、特定のプロモーターは特定の生物でのみ機能します。 そのため、バクテリアのプロモーターは植物では機能せず、逆もまた同様です。 木を明るく輝かせたいので、遺伝子をスーパープロモーターの下に置きます。これは常に機能します。 植物の場合、それはカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターである可能性があります。
幸いなことに、このウイルスとカリフラワーを探す必要はありません:)プロモーターと遺伝子の挿入場所を含む既製のプラスミドを購入できます。 たとえば、図のように。
次のステップでは、細菌培養物からインサートを使用してプラスミドを分離し、そこから遺伝子を切り取ります。 切断は制限酵素を使用して実行されます（酵素とプラスミドDNA溶液で機能する酵素のバッファーを追加するだけです）。 私たちが組み込んだ遺伝子の側では、プラスミドは、彼らが認識して切断するDNAのセクション（制限部位）を含んでいます。
遺伝子自体を切断せずに1か所でのみ切断される制限酵素を常に選択する必要があります（特定の制限酵素は、通常6つの特定のヌクレオチドで構成される特定の部位を常に認識します）。 たとえば、制限酵素EcoR1は、G'AATTC配列を検出すると常にDNAを切断し、1つの鎖と2番目の鎖が切断されます。
制限酵素が認識配列の真ん中で正確に切断しない場合、いわゆる「スティッキーエンド」がエッジに残り、DNAの一部が一本鎖になります。 このような末端には、「付着」という特性があります。これは、同じ一本鎖部分のシーケンスで他の粘着末端にドッキングします。 シーケンスが異なる場合、ドッキングは発生しません。 したがって、2つの制限酵素を使用して遺伝子を切り取ると、1つは遺伝子の開始点、もう1つは終了点になり、その開始点と終了点は異なる種類になり、それぞれの種類にのみつながります。 これは、遺伝子の向きを制御するために非常に重要です。これは、特定の方法で配列にサービスを提供する場合にのみ機能するためです。
一部の制限酵素は、中央で明確に切断され、「平滑末端」になります。 クロスリンクは鈍端で行うこともできますが、右側ではなく後方に遺伝子をステッチする可能性が50％あります。
遺伝子を切除した後、電気泳動を使用してプラスミド残基を取り除きます。
同様に、購入したプラスミドをプロモーターで切断し、切除した遺伝子と混合します。
リガーゼと出来上がりを追加します-35Sプロモーターとbl1遺伝子を持つクロスリンクシーケンスがあります。
繰り返しますが、すでに得られたこの構造で、バクテリアを変換します。 植物で機能するプロモーターを導入したので、そのようなバクテリアは光りません。 バクテリアのプロモーターを導入した場合、このステップでバクテリアの培養が明るくなります。
プロモーター、遺伝子、マーカー、およびその他の有用な部分を備えたプラスミドは、「発現用プラスミド」と呼ばれます。 トランスジェニック植物の生産にすでに使用できます。
これは2回目の保存です。 バクテリアを光らせる方法をすでに知っており、トランスジェニック植物を得るために必要なほぼすべてのものを手に入れました。
遺伝子工学のプロセスは、マルチステージおよびマルチタスキングであることに注意してください。 実生活では、作業はさまざまな段階で3〜4回の実験と同時に行われます。 細菌は一方で増殖し、もう一方ではプラスミドを制限し、3番目では遺伝子を分離します。 これは、私が説明したように、仕事の完璧にスムーズな進行が決してないという事実のために起こります。問題は常にさまざまな理由で発生し、それらを発見し、克服しなければなりません。 各段階でのエラーの検出でさえ、少なくとも数時間かかります。
そして問題を克服するためには、分子生物学者の全知識が必要であり、1つの試験管から別の試験管への一貫した滴下のためではなく、実験助手によって行うことができます:)
しかし、どのように輝く青いクリスマスツリーが得られるかについては、最終記事で説明します。 また、機器と試薬のリストを価格で提供します:)
UPD：
パート3 、最終版。